二、活化和平衡
萃取样品之前，活化平衡固相萃取填料，用一满管溶剂冲洗填料，对于膜片则用5-10 毫升。反相键合硅胶和非极性吸附介质，通常用与水互溶的有机溶剂如甲醇活化，然后用水或缓冲溶液平衡。甲醇湿润吸附剂表面和渗透键合烷基相，以使水更有效地湿润硅胶表面。有时在甲醇活化前使用预处理溶剂，此溶剂通常是与洗脱溶剂一样（见步骤五），用于消除固相萃取填料上的杂质及其对分析物的干扰，也可能该杂质只溶于强洗脱溶剂。正相类型固相萃取硅胶和极性吸附介质通常用样品所在的有机溶剂来预处理。离子交换填料用于非极性有机溶剂中的样品时，采用样品溶剂来预处理。对于极性溶剂中的样品，用水溶性有机溶剂活化，再用一定的pH、有机溶剂含量和盐浓度的水溶液平衡。为了使固相萃取填料从平衡到上样时都保持湿润，允许大约1mm 的预处理溶剂在滤片或膜片表面之上。如果样品是从一个贮液瓶或过滤管引入至固相萃取小柱，则多加入0.5mL 最后的平衡溶剂到1mL 的固相萃取小柱中，2mL 到3mL 小柱中，4mL 到6mL 小柱中，以此类推，这是为了保证在样品真正到达小柱之前防止填料干涸。如果在样品加入之前，填料干了，重复预处理过程。在重新引入有机溶剂之前，用水冲洗干净小柱中缓冲溶液的盐。如果恰当，此时样品贮液瓶可以用一个小柱连接头连接。
三、上样
用移液管或微量吸液管准确地将样品转移到小柱或贮液瓶中，样品必须以匹配固相萃取的形式存在。样品的总体积可以从1 微升到数升（见步骤一），当过量体积的水溶液被萃取时，反相硅胶填料渐渐失去预处理时所获得的溶剂化层，这就会降低萃取效率和样品的回收率。如果样品体积＞ 250mL，加入少量的水溶性有机溶剂（大约为10%）以适当地保持反相填料的湿润。对于每一个应用和使用条件，样品的最大容量是特定的。如果回收率较低或重现性不好，可以按以下方法检测分析物的流失：用一个连接头连接两个相同填料并预处理过的固相萃取小柱，当样品依次流过两根小柱，然后分开这两根小柱，分别洗脱。如果处于下方小柱的萃取物中发现分析物，则样品体积太大或填料太少，以导致分析物的流失。要提高目标化合物尽量保留在填料上，同时洗脱或沉淀不需要的化合物，可以调节pH、盐的浓度和样品溶液中有机溶剂的含量。为了避免堵塞固相萃取小柱的滤片（frits）或固相萃取膜片，可以在萃取之前预先过滤或者离心样品。用真空或正压，慢慢将样品溶液通过SPE 装置，流速会影响某些化合物的保留。一般来说，对于离子交换固相萃取，流速不应大于2 mL/min，对于其它的固相萃取，流速不应大于5 mL/min，对于萃取膜片，大约为50 mL/min。如果时间不是一个因素的话，一滴一滴的流速最佳。对于某些复杂的样品基质，额外的前处理是非常必要的。
四、淋洗
如果您的目标化合物被保留在填料上，使用与溶解样品相同的溶液，或另外一种不能洗脱目标化合物的溶液，去冲洗掉未保留的或不需要的物质。通常冲洗溶液不超过一个柱体积，固相萃取膜片需要5-10mL。
为去除不需要的和弱保留的物质，用一种比样品基质更强，但其强度又不能洗脱目标化合物的的溶剂去冲洗填料。典型的溶液是比最终洗脱溶剂的有机或无机盐的含量更少的溶液，也可以调节不同的pH来实现。与最后洗脱液完全不同极性的纯溶剂或溶剂混合物也可作为有效的洗脱剂。如果您的目标化合物不被保留在填料上，用相当于一个柱管体积的样品溶剂去洗脱管上残留的、需要的化合物，或用5-10mL去洗脱萃取膜片上的化合物。这种情况下，冲洗也作为洗脱的步骤来完成整个萃取过程。
五、洗脱
用少量能洗脱目标化合物的溶液（一般200μL-2mL，取决于柱管的大小，或者5mL-10mL，取决于膜片的大小）去清洗填料，但是要留下在清洗时未被洗下的杂质。收集洗脱液为进一步的分析做准备。 用两次少量液体洗脱目标化合物比用一次大量的体积更有效。当每次洗脱液停留在填料或膜片上为20 秒到1 分钟时，分析物的回收率最好，在这步中慢速或一滴一滴的流速是最有利的。